很多恐友因为在网络上搜索恐艾症和艾滋病区别，就看到各种关于艾滋病检测试剂的不同结论。其实相对于艾滋病检测的精度，主要是和艾滋病试剂本身，艾滋病检测方法有相当大的关系。而和具体的医院没有太大关系，所以也不要觉得三甲医院才能定乾坤，三级医院二甲医院就不行了，或者说不是初筛实验室就不行了，没有类似这个说法哈。主要还是具体初筛的试剂和使用艾滋病检测方法。另外有恐友经常问到艾滋病检测的假阳率和假阴率的问题，这个分别是由特异性和灵敏度两个标准来进行衡量的，特异性越高，假阳性就越低，灵敏度越高，那么假阴性也就越低。至于为什么艾滋病检测发光法等会有数值，这是吸光度值，这个是由于参考本底值和仪器都会产生误差，至于为什么有的恐友每一次检测值不一样，甚至有的恐友是越来越大，那其实也是一个随机。只要是小于1，且超过窗口期，就可以不用想可能被感染了。希望以下的一些专业知识有限的供艾滋病恐惧症患者做参考。祝各位恐友都早日脱恐。

1．免疫学方法

　　HIV抗体一般在人感染后几周逐渐出现，可延续至终生，血清学试验分为初筛和确认试验。最常用的初筛试验和确认试验分别是酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验(WB)。

表：常用的HIV实验室检测方法

1.1　酶联免疫吸附试验(ELISA)
　　ELISA法的基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物，酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物，然后加入酶底物，经酶的催化或水解作用，无色底物产生颜色，用肉眼、分光光度计观察结果。初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。
　　第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板，以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯，假阳性率较高。
　　第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用，特异性有了很大提高。
　　第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体，进一步提高了敏感性。
　　第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测，把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板，可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。

表：四代ELISA检测试剂的比较

1.2 免疫印迹试验（WB）

　　免疫印迹试验主要用于确认试验，基本原理是HIV全病毒抗原经过SDS-PAGE电泳，将分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状，每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100，再把它直接加到硝酸纤维素膜上，恒温震荡，使其充分接触反应，血清中若含有抗HIV抗体，就会与膜条上的抗原带相结合。加入抗人IgG酶结合物和底物后，即可使有反应的抗原-抗体结合带呈现紫褐色，根据出现条带情况判定结果。有报告说免疫印迹试验的特异性不是很好， 有大约2％的假阳性率，但免疫印迹试验依然是目前最常用的HIV确认试验。

1.3 免疫荧光试验(IFA)

　　基本原理为应用Ｈ-9或HUT-78培养细胞作为载体，用HIV感染细胞，该细胞内就会含有HIV抗原，将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上，固定，制备为抗原片，加入待检血清，待检血清中的抗 HIV抗体与抗原结合后，再与荧光素标记的抗人Ig结合，在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。

1.4 明胶颗粒凝集试验(PA)
　　

    PA的基本过程是先将样品稀释，然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒，混匀后保温(一般为室温)。当血清中有HIV抗体存在时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便，无需特殊仪器设备，适合对少量标本的检测。

1.5 斑点印迹试验(或免疫层析/或渗滤)
　　

   斑点印迹试验一般采用硝酸纤维素膜作固相载体， 用HIV抗原包被于固相载体，加入待测标本(可为血清，血浆，尿液和其它体液)，一定温度反应后洗去未结合于固相载体上的标本，包被抗原和被检血清中抗体结合，用胶体金(或胶体硒)代替底物连接在葡萄球菌蛋白Ａ上，金标记蛋白Ａ具有与人Ig结合的能力，因而可与被捕获的HIV抗体结合。若样品中有HIV抗体，则薄膜上就会产生一桔红色斑点(或线条)，一般3～10 min出结果，特异性较好， 较为适宜于偏远地区临床用血检测，但不适于城市地区的献血员筛查。

1.6 HIV抗原检测

　　HIV抗原通常检测的是 Ｐ24抗原，采用的方法通常为夹心法ELISA，俗称四代酶联法，具体过程大致为:将纯化的已知抗体包被在固相反应板孔底，当加入待测血清后，若血清中含有P24抗原则与包被抗体形成抗原-抗体复合物，再加入酶(HRP)标记的HIV抗体，在抗原上又结合了酶标记的抗体，加底物显色后，在酶标仪上读结果，其敏感度约为50～100pg/ml标本浓度。

1.7 化学发光法

从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay，CL E IA ) ，应属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂， 操作步骤与酶免分析完全相同。以酶标记生物活性物质(如酶标记的艾滋病抗原或抗体) 进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物， 在信号试剂作用下发光， 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶（AL P) ， 它们有各自的发光底物。

2．分子生物学方法

随着生物技术的发展，核酸检测得到了人们越来越多的重视，它可直接检查HIV RNA，可在发现血清学变化之前检测HIV感染，而且比Ｐ24抗原检测方法更灵敏。

2.1 多聚酶链反应（PCR）检测法

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

② 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③ 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。检测HIV-RNA，需要先利用逆转录反应将RNA转录为cDNA，继而以cDNA为模板进行PCR扩增即可，这样的反应称为RT－PCR。

2.2 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。是使用荧光基团标记探针，5′端标记荧光基团R，3′端标记淬灭基团Q，在没有PCR扩增时，由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近，使荧光基团被淬灭，不发荧光;而当PCR扩增时，引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上，荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间，利用Taq酶的5′-3′外切酶活性，将荧光探针水解，荧光基团被释放出来，由于在空间上与淬灭基团分开，则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到，一边扩增，一边检测，这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了PCR从半定量到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点。

2.3 支链DNA检测法—ｂDNA

ｂDNA是定量检测血浆中的HIV-1型RNA的一种方法。bDNA是指人工合成的带有侧链的DNA片段，在其每个侧链上都可以标记被激发的标记物。将HIV的RNA通过离心从病毒颗粒中释放出来，然后用捕获探针1将其捕获到微孔中。捕获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合，又与预放大探针结合。后者再与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别与病毒RNA的pol基因的不同区域特异结合。在微孔中形成了HIVRNA-寡核苷酸复合物。再加入一种化学发光底物孵育后可放大化学发光信号。通过发光强度来定量，因为发光强度与样品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在扩增物的交叉污染，这较PCR是一大进步。bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针，可以方便地检测HIV某些变异株，但灵敏度不及PCR，提高bDNA灵敏度是一大难点。

2.4 核酸序列依赖性扩增法－NASBA

　　NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在 42℃进行 ，可在 2h内将RNA模板扩增约 109倍。NASBA原理是提取病毒RNA，加入AMV逆转录酶、RNA酶Ｈ、Ｔ7RNA聚合酶和引物进行扩增 。整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中，引物Ｉ与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA，形成RNA杂合体，随即RNaseH降解RNA，引物Ⅱ与cDNA退火， 在反转录酶作用下合成第二条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下，经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相，对模板进行大量扩增。

2.5 转录介导的扩增技术—TMA

　　TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶Ｈ活性。反应在 41.5℃进行 ，可在 1h内将RNA模板扩增约 109倍。

　　2.6 连接酶酶促链式反应(LCR)

　　LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术，是继PCR后新发展的一种较有前景的体外扩增技术。它的原理就是由2段寡核苷酸单链DNA探针与目标序列杂交，当该2段DNA探针与没有发生突变的模板褪火后，如果2探针是紧邻的，中间没有核苷酸间隔，则可在连接酶作用下连接起来，连接以后的新链又可以作为模板，引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核苷酸的碱基突变，则连接反应不能发生，扩增反应终止。　　　　　　　　　　　　　

以上介绍的几种核酸检测方法各有其特点

几种核酸检测方法的比较

3．细胞培养与检测

常规方法是将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养， 经适当周期培养后测定培养液HIVｐ24抗原， 进而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感染。细胞培养方法与血清学方法相比，专一性很强，不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或PCR， 因为必须有一定数量的感染细胞存在才能培养出病毒来。

　　以上简述了HIV的流行概况和实验室的检测技术，相信随着HIV实验室检测技术的不断的改进，尤其是核酸检测技术的不断应用，HIV检测的窗口期将会逐步缩短，经输血传播HIV可能性也将会大大减小。